內(nèi)容

操作過程

一般技術(shù)要點說明

方法摸索優(yōu)化

目標(biāo)優(yōu)化梯度條件，確定分析波長。

1、 樣品溶劑選擇；

2、 濾膜吸附試驗；

3、 DAD檢測器下，波長選擇主成分大吸收或平臺處。

4、 分離條件選擇；

5、 色譜柱對比；（根據(jù)情況酌定）

6、DAD檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料（制劑時需同時進(jìn)行空白輔料破壞）等成分分離。

1、 一般在無參考標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)的方法無法直接套用時,需進(jìn)行此項內(nèi)容，如3類藥。

2、樣品溶劑：對樣品有很好的溶解能力，實驗室自然放置穩(wěn)定存放12小時以上，與流動相有良好的互溶效果。

3、續(xù)濾液峰面積達(dá)穩(wěn)定大值，續(xù)濾液體積在5ml以下時較為適宜，否則需要重新篩選溶劑。

4、破壞程度10%左右（5%—15%）為宜，2mol/l酸或堿90℃水浴12小時無破壞即視為樣品穩(wěn)定，不必再追求降解度。4500lx光照48小時，樣品粉末及溶液需要同時做。破壞后的樣品溶液及空白溶劑均需調(diào)整至流動相pH方可進(jìn)樣，可避免對色譜柱產(chǎn)生影響。如果破壞過20%，需要降低破壞條件。

5、分離度良好，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有高洗脫能力過程，目的證明所有的雜質(zhì)成分均能夠被洗脫檢測。

7、方法摸索優(yōu)化實驗一般是不上資料的，只是體現(xiàn)在實驗記錄本中，除非是沒有方法依據(jù)時，如3類藥申報時，梯度選擇及波長選擇等均需要在資料中體現(xiàn)。

8、方法優(yōu)化完成后，后在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進(jìn)行分析測定，具有可比性。

9、方法摸索優(yōu)化實驗采用工藝已經(jīng)確定的實驗室小試、實驗室放大樣品進(jìn)行，前期用于原料合成樣品配合檢測時，可以采用大范圍的梯度洗脫進(jìn)行模糊檢測分析。

專屬性

目的為了驗證方法對目標(biāo)成分檢測的區(qū)分能力及的雜質(zhì)分析評價。

DAD檢測器或適宜的通用型檢測器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料，各雜質(zhì)對照品等在同一天進(jìn)行分析，可以作為申報資料中雜質(zhì)譜的論述內(nèi)容。

1、參照上述過程進(jìn)行破壞樣品制備，空白及陰性樣品都要做。

2、分離度良好，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

3、梯度要有高洗脫能力過程。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同一天同一人，用同一臺機器，對所有樣品進(jìn)行分析測定，具有可比性。

5、本部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)資料，佳采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。

當(dāng)色譜條件與有關(guān)物質(zhì)檢查方法相同時，專屬性實驗數(shù)據(jù)可以共用。

出圖時主成分峰的紫外光譜圖及峰純度圖均要出圖。

檢測限

信噪比法，S/N≥3倍時的濃度為檢測限。

空白，再進(jìn)對照品濃溶液（1mg/ml），在主峰相同位置處選擇空白溶劑1—2min范圍的基線積分得出峰高，按照峰高的3倍計算樣品濃度，直接用濃溶液稀釋至目標(biāo)濃度附近即可，資料中體現(xiàn)至少3張圖（空白溶劑、濃溶液、及稀釋液）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍時的濃度為定量限。

按照基線峰高的10倍計算樣品濃度，直接用檢測限濃溶液稀釋至目標(biāo)濃度附近即可，連續(xù)進(jìn)樣6針，計算峰面積RSD<2%（可以放寬至5%），資料中體現(xiàn)6張圖（6張稀釋液）。與檢測限在同一天做，出圖時縱軸標(biāo)尺與檢測限一致，減少審評員審圖時的信息誤導(dǎo)，提高審圖效率。

線性與范圍

5點或7點法，酌情設(shè)置。

個點在定量限濃度，中間點為濃度，后一個點為200%濃度（160%或180%），必須采用稀釋法，不得采用調(diào)整進(jìn)樣量的方式。r>0.999。

采用對照品進(jìn)行。

線性范圍一定要將回收率試驗的高濃度包含進(jìn)去，否則回收率濃度過線性范圍，缺乏定量依據(jù)，這個錯誤常見。

精密度

同一份供試品（樣品）溶液，連續(xù)進(jìn)6次。

計算峰面積RSD<2%，資料中體現(xiàn)7張圖（1張空白，6張樣品液）。

進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。

溶液穩(wěn)定性

與精密度在同一天穿插進(jìn)行，實驗前進(jìn)行良好的排序設(shè)置，能共用的圖盡量共用減少工作量。以下時間點必做（除非已知穩(wěn)定情況可減少時間點）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

實驗過程中可取精密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

做7至8個時間點，在撰寫申報資料時后以6個數(shù)據(jù)填報。

溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)至少做到16h穩(wěn)定（盡量做得更長時間，都是自動進(jìn)樣，一個過夜就至少在12小時以上，時間太短無法證明溶液穩(wěn)定性），特殊情況下可以采用低溫進(jìn)樣器或特殊的保存方法或現(xiàn)配現(xiàn)分析等操作，但要求有數(shù)據(jù)作為支持依據(jù)，方可將特殊處理方法定入標(biāo)準(zhǔn)。

6個數(shù)據(jù)計算峰面積RSD<2%。

重復(fù)性

同一批號樣品，同一人員同法操作分別稱取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進(jìn)1次。

計算含量RSD<2%，資料中體現(xiàn)9張圖（1張空白，2張對照，6張樣品）。

進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。

中間精密度

同一批號樣品，不同人員，不同設(shè)備，同法操作，分別稱取2份對照品及6份供試品（樣品）溶液，各進(jìn)1次。次日操作，避免產(chǎn)生壓針的疑問（萬一審評老師沒有注意到設(shè)備編號，所以別自找麻煩，次日操作）。對照品也要重新稱取。

與重復(fù)性的6個數(shù)據(jù)，共同參與統(tǒng)計，計算12個含量數(shù)據(jù)結(jié)果，RSD<2%，資料中體現(xiàn)18張圖，其中重復(fù)性9張，次日數(shù)據(jù)9張（1張空白，2張對照，6張樣品）。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。

度

采用回收率試驗方式進(jìn)行，通常采用直接回收率實驗法，按照80%、、120%比例分別稱取樣品，同法操作，每個比例各3份樣品，各進(jìn)1次。

以中間精密度的含量均值作為理論含量，計算回收率，回收率變動范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。

原料藥采用直接回收率。

制劑采用加樣回收率測定：

采用20片或粒制劑單位終產(chǎn)品混合研碎后，按比例稱取進(jìn)行加樣回收，加樣回收率采用80%、、120%比例，1:1加入，加樣回收率不能達(dá)標(biāo)時（輔料有吸附或干擾較大時），方可采用直接回收率。回收率變動范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖（1張空白，2張對照，9張樣品）。

耐用性實驗

改變色譜柱

不同的色譜柱，共3個。比較分離度，保留時間，含量測定結(jié)果。

如果不足3個可采用多個批號或不同多個批號的方式，不能采用廢柱子進(jìn)行實驗。

好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進(jìn)行。

3個的色譜柱共15張圖（每個色譜柱1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。

流動相比例

流動相的低組分比例變化約±5%。

好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進(jìn)行。

3個不同比例的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

流速變化

流速±10%。

好在同一天對倆份樣品溶液和倆份對照溶液進(jìn)行。

3個不同流速的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

不同pH

pH值±0.2

好在同一天對倆份樣品溶液和兩份對照溶液進(jìn)行。

3個不同pH的流動相15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

柱溫

柱溫±5℃

25℃、30℃（或優(yōu)參數(shù)）、35℃

好在同一天對倆份樣品溶液和一份對照溶液進(jìn)行。

3個不同溫度15張圖（每個比例1張空白，2張對照，2個樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗證的第1批樣品進(jìn)行。優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

0天樣品檢測

方法學(xué)結(jié)束且各項考察數(shù)據(jù)符合要求后，對3批生產(chǎn)線驗證樣品及被仿品在同一天進(jìn)行檢測。此數(shù)據(jù)在申報資料產(chǎn)品單中體現(xiàn)，且可作為穩(wěn)定性的0天數(shù)據(jù)。

雙樣雙針。對照品也為雙樣雙針。